21世纪以来是南京水利科学研究院深化科技体制改革、学科和各项事业发展最为迅速的重要时期。2000年，国务院办公厅下发《国务院办公厅转发科技部等部门关于深化科研机构管理体制改革实施意见的通知》和《国务院办公厅转发科技部等部门关于非营利性科研机构管理的若干意见（试行）的通知》，南京水利科学研究院被确定为全国社会公益类科研机构科技管理体制改革试点单位。2001年，水利部南京水文水资源研究所成建制并入；2002年和2009年，水利部农村电气化研究所和水利部南京水利水文自动化研究所先后划归南京水利科学研究院管理。2009年9月中央编办批复南京水利科学研究院更名为“水利部 交通运输部 国家能源局南京水利科学研究院”。2017年4月中央编办批复南京水利科学研究院为公益二类事业单位、水利部大坝安全管理中心为公益一类事业单位。

2001年成建制并入的“水利部水文水资源研究所”，源自1977年水利电力部恢复重建的水利电力部南京水文研究所，恢复重建的直接原因是1975年8月淮河特大洪水导致板桥、石漫滩两座大型水库垮坝造成巨大损失，同时也是因为当时的水文基础研究已不能满足水文工作需要。当时水利电力部明确该所的任务是：“密切结合当前生产建设中的重大技术问题。同时，要加强水文基础理论研究”。20世纪70年代末到80年代初我国水资源问题日趋突出，为适应经济建设和改革开放的需要，1985年经水利部批准更名为“水利部南京水文水资源研究所”，明确今后的科研任务为：“由面向工程水文计算转变为面向整个水文水资源，并落实承担水文测验科研任务，为整个社会发展服务”。1986年，被定位为社会公益型研究所。30余年来，在暴雨洪水形成和水旱灾害发生发展规律、水文循环大气过程、洪水预报与调度、防洪决策支持系统、水资源系统分析合理配置及运行管理和新技术应用研究等方面具有明显特色和重要影响，在国内具有较高的学术地位。近年来面向国家和行业发展需求，重点发展了水文学理论与方法等传统专业方向，保持了水文科学与防洪抗旱减灾等领域的传统研究优势和领先地位；扩大了水资源可持续与高效利用、水资源配置与管理、地下水合理开发利用、水环境与水生态、水利信息化等方向的研究优势；拓展了气候变化影响及对策、国际河流、实验水文等研究方向。

2002年1月划归管理的水利部农村电气化研究所（亚太地区小水电研究培训中心），源自1980年11月水电部批准建立的国际小水电研究培训中心（又称水电部小水电开发设计研究所）。依托该所建立的亚太地区小水电研究培训中心是我国政府和联合国开发署（UNDP）及联合国工业发展组织（UNIDO）合作成立的国际区域性组织，是亚洲及太平洋地区及全球范围内的小水电研究、培训、信息及咨询机构，是我国小水电对外合作的窗口。主要开展农村水电行业管理的政策法规研究、农村水电行业发展规划编制、农村水电行业技术标准研究、小水电技术研究和工程质量检测，为发展中国家提供小水电技术培训和援助。水利部农村水电工程技术研究中心、可再生能源及农村电气化浙江国际科技合作基地、小水电专业技术性期刊中文《小水电》和英文《SHP News》编辑部、中国水力发电工程学会小水电专委会和中国水利学会水力发电专委会均设在该所。

2009年划归管理的水利部南京水利水文自动化研究所，前身是创建于1940年的中央水利实验处南京水工仪器实验室，是我国最早成立的水利水文科学研究机构，建国后更名为南京水文仪器研究室，1981年重新组建，是目前我国唯一从事水利信息化和水利自动化技术研究的专业研究所。创建以来，虽历经多次变迁，但始终坚持水利水文基础技术研究，始终坚持为水利防灾减灾、为国家公共安全服务。主要开展水利防灾减灾关键技术和装备研究，水文仪器、岩土工程仪器、水利水文自动化系统设备研发和检验测试技术研究，水文计量、测验标准研究，水利水文（水环境、水生态）监测预报技术研究，水文援外，水利信息化技术和水文技能培训。

2007年，经水利部批准，依托南京水利科学研究院成立水利部应对气候变化研究中心，主要开展水利部和国家有关部门应对气候变化对水科学和水工程影响科学研究、重大问题论证、技术咨询和服务，参与中国和相关国家、国际组织机构气候变化合作谈判，参与编写中国国家应对气候变化白皮书、国家气候变化影响评价报告、国家应对气候变化总体战略报告和规划。2011年，经水利部批准，依托南京水利科学研究院成立水利部水闸安全管理中心。主要开展全国水闸基础数据库信息系统开发建设，病险水闸安全鉴定核查，水闸安全管理法规与标准拟订，水闸工程应急管理，病险水闸检测、鉴定和评估等工作。2024年，经国家市场监督管理总局批准，依托南京水利科学研究院组建国家水文计量站，主要承担研究、建立、保存和维护计量标准，开展授权范围内的量值传递，执行计量检定任务，开展计量检定、校准、测试用设备和方法的研究，组织或参加计量比对，提供计量校准、测试服务等工作。

这一时期，南京水利科学研究院聚焦国家战略与水利交通能源行业重大需求，不断加强创新发展顶层设计。2004年，南京水利科学研究院制订了《院学科建设与学术发展规划》，规划确定的战略目标为：“致力于水利水电水运领域的科学发现与技术创新，通过科学研究、科技咨询、技术转移、人才培养，服务于国家经济建设和社会可持续发展，努力为我国资源环境、水利、交通、能源行业的科技进步不断做出基础性、战略性、前瞻性的重大创新贡献”。战略定位为：“成为水利水电水运行业完成国家重大涉水科研任务的龙头和纽带；成为国际上同行关注的国家水利科学研究院；成为国家水利水电水运建设事业的“外脑”和“思想库”；成为水利共性关键技术的源头，引导水利科技潮流”。学科发展布局为：“继续巩固和保持河流海岸、泥沙、水工水力学、岩土工程、水工新材料等学科的传统优势，强化和加速水利水电工程和水文水资源学科的建设，扶持和形成流域生态环境、高新技术应用等新的学科增长点，形成干湿结合、软新并重、结构合理、优势突出的水利学科群”，确定了水文水资源、水工水力学、河流海岸、岩土工程、材料结构、大坝安全与管理、水利部农村电气化等7个研究所的37个主要研究方向。

2009年，南京水利科学研究院制订了《国家水利科技创新（南方）基地建设与科研基础实施建设规划》，规划包括《学科建设实施方案与科研人才发展规划》和《科技创新平台建设规划》两部分。《学科建设实施方案与科研人才发展规划》明确了2008~2020年院学科发展“三步走”的发展战略，确定了学科发展的总体目标：“紧紧围绕水利交通能源的行业需求，在保持传统学科优势的同时，面向国际发展前沿，根据国家发展需求，加快培育新实验水文学、气候变化影响及应对、城市水力学、农村水利、生态水文等新的优势学科；加强基础科学和应用基础研究，积极开拓国内外科技市场，保持我院科研和科技开发的平稳快速发展；加强国家级科技平台和科研基础建设，提升科技创新能力；加强人才队伍建设和引进力度，争取高层次人才培养取得新突破；促进院所和谐，营造更加良好的科研环境，为将我院建设成为国际有重要影响、国内一流的国家级综合性行业科研机构而努力”，将原有37个研究方向整合成35个研究方向，并拟定拓展16个新方向，总研究方向达51个。

2017年，南京水利科学研究院制订了《院“十三五”及中长期发展规划》，决定实施“三个六”创新工程，到2020年建设“六个”达国际领先或先进水平的优势学科方向，建成支撑我院未来30年可持续发展的“六大”创新研发基地，在学科发展与布局、高端人才队伍培养、国家级科研平台、重大科研成果、科技支撑与服务能力、管理体制机制改革等“六个方面”实现新的突破，为加快建成国际一流综合性水利科研院所提供支撑和保障。其中，按照“突出重点学科、巩固优势学科、拓展新型学科、加强交叉学科”的原则，统筹优化和调整学科布局，将水文基础理论与方法、通航水力学与枢纽工程、河流海岸动力学与工程泥沙、水库大坝建设与安全保障、水（港）工新材料与工程结构、水旱灾害防控理论与方法等6大优势学科建成综合创新能力达国际领先或先进水平的优势学科方向，新拓展建设15个左右新学科，形成拥有60个左右，能有效支撑行业改革发展、专业方向齐全、交叉互融、优势明显的学科体系布局。

2021年，南京水利科学研究院制订了《院“十四五”及中长期发展规划》，坚持以提升国家重大战略和行业中心工作科技支撑服务能力为根本出发点，以原创基础性、宏观战略性和关键核心技术研发为核心，以深化科技体制机制改革为动力，紧密围绕“建设国际一流水利科研院所”一个目标，聚焦学科建设、人才、平台等九项重点建设任务，提升科技创新、科技支持和核心竞争三大能力，实现一流学科、一流人才、一流平台、一流成果、一流服务、一流管理等六个一流，到2035年建院100周年之际整体进入国际一流水利科研院所前列。其中，对标国际学科发展前沿，强化学科体系建设与优化布局和行业高质量发展新需求的交叉融合，在巩固提升“六大”优势专业方向的基础上，力争拓展培育水资源集约安全利用、河湖生态保护治理、城市洪涝灾害防御等2-3个国际一流的专业研究方向；加快推进传统学科转型升级，强化与新发展理念、现代信息技术融合，拓展培育智慧与绿色水利水运、工程智慧监管等15-20个在国内具有重要影响力的专业方向。

党的十八大以来，南京水利科学研究院牢记国家战略科技力量使命担当，坚持“四个”面向，以创新发展规划为引领，以学科建设为龙头，整合全院科研资源，持续优化完善内设研究机构布局。2013年，成立了生态环境研究中心、农村水利科学研究推广中心和海洋资源利用研究中心；2015年，成立地下水研究中心、湖泊治理研究中心、河湖库底泥处理与资源化利用研究中心、工程防腐与防护研究中心和水工与港工结构抗震研究中心；2018年，成立航道安全技术研究中心；2019年，成立节水研究中心、通航建筑物（枢纽）安全监测与评估中心、海岸保护与修复研究中心和海堤安全与风暴潮防灾减灾研究中心，并在生态环境研究中心、农村水利科学研究推广中心的基础上，成立生态环境研究所和农村水利研究所；2022年，成立大数据与智慧水利研究中心和河湖保护与治理技术研究中心；2023年，成立水利工程动物堤害隐患防治研究中心、水科学发展战略研究中心、计量与标准研究中心和水土保持研究中心。

至2025年，经调整拓展，南京水利科学研究院已拥有60多个研究方向，涉及地球科学、力学、材料科学、能源科学技术、土木建筑工程、水利工程、交通运输工程、环境科学技术等多个一级学科。主要包括：水文学理论与方法、实验水文与新技术应用、防洪抗旱与减灾、水资源调配和管理、地下水保护与利用、生态水文与水资源保护、气候变化影响与对策、智慧水利；通航水力学、河湖环境与生态水力学、枢纽与闸坝工程水力学、地下水与工程渗流、水力安全监测与评估、城市水力学、防洪水力学与应急抢险技术、绿色航运与智慧通航建筑物；河流动力学与河湖治理、河口治理与保护、海岸与港口工程、波浪与结构物相互作用、海洋资源利用、河流海岸生态环境工程、水沙原型观测与量测、河口海岸风暴潮灾害防治；岩土试验技术、岩土力学基本理论、地基与基础工程、土石坝工程、环境岩土与地质灾害防治、海洋岩土工程、疏浚土资源化利用、岩土工程智能监测；水（港）工高性能混凝土新材料、水（港）工程腐蚀机理与防护、水（港）工结构基本理论与试验、水（港）工程病害安全诊断、水工程险情应急处置与加固修复、水工程病害无损检测方法与智慧诊断；大坝安全管理政策与法规、安全监测与隐患探测、安全评价与病害诊断、风险评估与应急管理、水库大坝智慧监管、深水环境安全检测与修补加固；生态水力学、水文地球化学、水生态健康学；农田高效灌排技术及环境效应、智能灌溉技术、水土保持智慧监测监管；农村水能资源保护与利用、农村水电生态与安全保障、可再生能源多能互补发电与农村再电气化、农村水利水电智慧化；水文水资源监测与应用、水旱灾害和应急监测与预警、水环境水生态监测、工程安全监测与风险管理、水利工程运行自动化、水利标准与计量和检测、水利水文数据融合与智能应用等。